Nizozemski istraživači kombiniraju CRISPR i bioluminiscenciju u eksperimentalnom testu zazarazne bolesti

Novorazvijeni noćni protein mogao bi ubrzati i pojednostaviti dijagnozu virusnih bolesti, tvrde nizozemski istraživači.
Njihova studija, objavljena u srijedu u ACS Publications, opisuje osjetljivu metodu u jednom koraku za brzu analizu virusnih nukleinskih kiselina i njihovog izgleda pomoću svijetlećih svijetloplavih ili zelenih proteina.
Identifikacija patogena otkrivanjem njihovih otisaka nukleinskih kiselina ključna je strategija u kliničkoj dijagnostici, biomedicinskim istraživanjima i praćenju sigurnosti hrane i okoliša.Naširoko korišteni testovi kvantitativne lančane reakcije polimerazom (PCR) vrlo su osjetljivi, ali zahtijevaju sofisticiranu pripremu uzorka ili tumačenje rezultata, što ih čini nepraktičnima za neke zdravstvene ustanove ili postavke ograničenih resursa.
Ova grupa iz Nizozemske rezultat je suradnje između znanstvenika sa sveučilišta i bolnica na razvoju brze, prenosive i jednostavne dijagnostičke metode nukleinske kiseline koja se može primijeniti u različitim okruženjima.
Inspirirani su bljeskovima krijesnica, sjajem krijesnica i sićušnim zvijezdama vodenog fitoplanktona, a sve pokreće fenomen koji se zove bioluminiscencija.Ovaj efekt sjaja u mraku uzrokovan je kemijskom reakcijom koja uključuje protein luciferazu.Znanstvenici su ugradili proteine ​​luciferaze u senzore koji emitiraju svjetlost kako bi olakšali promatranje kada pronađu metu.Iako to čini ove senzore idealnima za detekciju na mjestu liječenja, trenutno im nedostaje visoka osjetljivost potrebna za kliničke dijagnostičke testove.Iako metoda uređivanja gena CRISPR može pružiti ovu mogućnost, zahtijeva mnogo koraka i dodatnu specijaliziranu opremu za otkrivanje slabog signala koji može biti prisutan u složenim, šumnim uzorcima.
Istraživači su pronašli način da spoje protein povezan s CRISPR-om s bioluminiscentnim signalom koji se može otkriti jednostavnom digitalnom kamerom.Kako bi bili sigurni da ima dovoljno RNA ili DNA uzoraka za analizu, istraživači su izveli pojačanje rekombinazom polimeraze (RPA), jednostavnu tehniku ​​koja radi na konstantnoj temperaturi od oko 100°F.Razvili su novu platformu nazvanu Luminescent Nucleic Acid Sensor (LUNAS), u kojoj su dva CRISPR/Cas9 proteina specifična za različite susjedne dijelove virusnog genoma, svaki s jedinstvenim fragmentom luciferaze pričvršćenim na njih iznad.
Kada je prisutan specifični virusni genom koji istraživači ispituju, dva proteina CRISPR/Cas9 vežu se na ciljnu sekvencu nukleinske kiseline;postaju u neposrednoj blizini, dopuštajući netaknutom proteinu luciferaze da se formira i emitira plavo svjetlo u prisutnosti kemijskog supstrata..Kako bi uzeli u obzir supstrat potrošen u ovom procesu, istraživači su koristili kontrolnu reakciju koja je emitirala zeleno svjetlo.Epruveta koja mijenja boju iz zelene u plavu označava pozitivan rezultat.
Istraživači su testirali svoju platformu razvijanjem testa RPA-LUNAS koji otkrivaSARS-CoV-2 RNAbez zamorne izolacije RNK, i pokazao svoju dijagnostičku učinkovitost na uzorcima nazofaringealnog brisa izCOVID 19pacijenata.RPA-LUNAS je uspješno otkrio SARS-CoV-2 unutar 20 minuta u uzorcima s RNK virusnim opterećenjem od samo 200 kopija/μL.
Istraživači vjeruju da njihov test može lako i učinkovito otkriti mnoge druge viruse.“RPA-LUNAS je atraktivan za testiranje zaraznih bolesti na mjestu liječenja”, napisali su.